Заряд белка складывается из вкладов ионизируемых групп — боковых цепей Asp, Glu, Cys, Tyr, His, Lys, Arg и двух концевых групп. Каждая ведёт себя как слабая кислота со своим pK:
Q(pH) = Σосновные ni · 10−pH / (10−pKi + 10−pH) − Σкислые nj · 10−pKj / (10−pKj + 10−pH)
pI — корень уравнения Q(pH) = 0. Отсюда главное правило: при pH ниже pI белок заряжен положительно, выше — отрицательно.
| Группа | pK | Группа | pK |
|---|---|---|---|
| Asp (D) | 4.05 | His (H) | 5.98 |
| Glu (E) | 4.45 | Lys (K) | 10.0 |
| Cys (C) | 9.0 | Arg (R) | 12.0 |
| Tyr (Y) | 10.0 | α-COOH | 3.55 |
| α-NH₃⁺ | 7.5 | шкала Bjellqvist, как в ProtParam | |
Буфер работает в окне pKa ± 1, поэтому его выбирают под конкретный рабочий pH.
| Буфер | pKa, 25 °C | Рабочий pH | ΔpKa / °C | Примечание |
|---|---|---|---|---|
| Ацетат натрия | 4.76 | 3.6–5.6 | ≈ 0 | кислая область |
| MES | 6.10 | 5.5–6.7 | −0.011 | не связывает металлы |
| Bis-Tris | 6.46 | 5.8–7.2 | −0.017 | |
| PIPES | 6.76 | 6.1–7.5 | −0.0085 | плохо растворим в кислой форме |
| Фосфат натрия | 7.20 | 5.8–8.0 | −0.0028 | осадок с Ca²⁺ и Mg²⁺ |
| MOPS | 7.20 | 6.5–7.9 | −0.011 | гели с РНК |
| HEPES | 7.48 | 6.8–8.2 | −0.014 | совместим с магнием |
| Tris | 8.06 | 7.0–9.0 | −0.028 | первичный амин; сильно зависит от температуры |
Температура. pKa Tris падает на 0.028 единицы на градус нагрева, то есть на холоде pH растёт: буфер pH 8.0, разведённый при 25 °C, в холодной комнате при 4 °C окажется около 8.0 + 0.028 · 21 ≈ 8.6. Поэтому pH выставляют при рабочей температуре.
Поглощают при 280 нм только Trp, Tyr и дисульфиды (Pace et al., 1995):
ε₂₈₀ = 5500 · n(Trp) + 1490 · n(Tyr) + 125 · n(цистинов) → c = A₂₈₀ / (ε · l)
Без триптофанов ε маленький, и на нанодропе такой белок почти не виден — тогда концентрацию меряют по Брэдфорду. Загрязнение нуклеиновыми кислотами видно по A₂₆₀/A₂₈₀: у чистого белка ≈ 0.57, у РНК ≈ 2.
| T7-промотор + lac-оператор | Работает только в BL21(DE3); до индукции ИПТГ репрессор LacI глушит систему. |
| His6 | Хелатирует Ni²⁺ — очистка на Ni-NTA, элюция имидазолом. |
| MBP | 40 кДа, резко повышает растворимость и даёт вторую аффинность на амилозе. |
| Сайт TEV | ENLYFQ↓S — здесь протеаза отрезает метки от целевого белка. |
| LIC | Клонирование без лигазы: T4-полимераза делает длинные однонитевые концы, которые просто отжигаются со вставкой. |