Домашнее задание перед лабораторной

Сколько РНК-связывающих доменов достаточно?

Эволюция архитектуры dsRBD в белках ADAR. Перед тем как прийти в лабораторию, разберитесь с плазмидой, в которой мы будем экспрессировать белки, и научитесь предсказывать свойства белка по его последовательности. Всё считается прямо здесь, в браузере.

Анна Передерина, Арина Мазурова, Артур Сафин, Максим Марченко

Задания

Ответы проверяются прямо на странице; числа сверяются с допуском. Ничего никуда не отправляется — это тренажёр, а не контрольная.

А. Разбираемся с вектором

1. Откройте карту плазмиды. Какой размер вектора в парах нуклеотидов?
   Проверить
2. Каким антибиотиком нужно селектировать бактерии с этой плазмидой?
   — выбрать — ампициллинканамицинхлорамфениколтетрациклин Проверить
   Подсказка

   Найдите на карте ген устойчивости и посмотрите его описание в таблице элементов.
3. Сколько пар нуклеотидов занимает кодирующая последовательность MBP и сколько это аминокислот?
   Проверить
   Проверить
   Подсказка

   Щёлкните по MBP на карте — координаты подставятся сами, а длина фрагмента появится под последовательностью.

Б. Считаем свойства белка

4. Откройте калькулятор и загрузите готовую последовательность MBP. Чему равны его изоэлектрическая точка и молекулярная масса в кДа (округлите до десятых)?
   Проверить
   Проверить
   Проверьте себя

   Скопируйте ту же последовательность в ExPASy ProtParam — числа должны совпасть.
5. Теперь в списке готовых последовательностей возьмите «Человек, ADAR2 — dsRBD1» и посчитайте pI одного отдельного домена.
   Проверить
6. Сравните: pI отдельного dsRBD и pI MBP. Какой заряд будет у каждого из них в буфере с pH 7.5?
   — выбрать — оба положительные dsRBD положительный, MBP отрицательный dsRBD отрицательный, MBP положительный оба отрицательные Проверить
   Почему так

   Сахарофосфатный остов РНК заряжен отрицательно, и поверхность dsRBD, которая с ним контактирует, обогащена лизинами и аргининами. Отсюда и высокий pI. MBP ничего не связывает из нуклеиновых кислот, и его pI лежит около 5 — при pH 7.5 он заряжен отрицательно. Это же различие используют при очистке на ионообменнике.

В. Выбираем буфер

Буфер работает в пределах pKa ± 1, а рабочий pH берут на 1–1.5 единицы в стороне от pI белка. Подробности — во вкладке Справка.

7. Вы приготовили Tris-HCl pH 8.0 при комнатной температуре (25 °C) и поставили колонку в холодную комнату (4 °C). Каким станет pH этого буфера? Для Tris ΔpKa/ΔT = −0.028 единицы на градус.
   Проверить
8. В буфер для связывания РНК нужно добавить 5 мМ MgCl₂. Какой буфер для этого не годится?
   — выбрать — HEPESTrisфосфат натрияMOPS Проверить
   Подсказка

   Один из этих анионов даёт нерастворимую соль с двухвалентными катионами.
9. Какой буфер из таблицы возьмёте, если нужен рабочий pH 4.8?
   — выбрать — ацетат натрияMESPIPESTris Проверить
10. N-концевой конструкт ADAR2 человека имеет pI 7.11. Вы хотите посадить его на анионообменник — значит, белок должен быть заряжен отрицательно, а pH — на единицу-полторы выше pI. Какой буфер подойдёт?
    — выбрать — ацетат натрия, pH 4.8MES, pH 6.0 фосфат натрия, pH 7.2Tris, pH 8.5 Проверить
    Как рассуждать

    Сначала выбираем pH: он должен быть выше pI на 1–1.5, то есть примерно 8.1–8.6. Потом ищем буфер, у которого этот pH попадает в диапазон pKa ± 1. Фосфат при pH 8.2 уже на самом краю своего диапазона и держит плохо.

Г. Эволюция архитектуры

11. В таблице внизу страницы «Свойства белка» перечислены N-концевые конструкты всех наших организмов. У кого из них больше всего dsRBD?
    — выбрать — Человек, ADAR1 p150Человек, ADAR2 Дрозофила, AdarКальмар, ADAR2 Гидра, ADAR Проверить
12. Сколько dsRBD у ADAR1 человека?
    Проверить
13. А у какого белка из нашего набора dsRBD всего один?
    — выбрать — Человек, ADAR2Дрозофила, Adar Кальмар, ADAR1Гидра, ADAR Проверить
    Обратите внимание

    Этот белок — самый длинный из наших N-концевых конструктов, но почти вся его длина приходится на неструктурированные участки, а РНК-связывающий домен там один.